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退火溫度退火溫度為引物和模板結(jié)合時候的溫度參數(shù)，它是影響PCR特異性的較重要因素。 　　
在模板變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃(某個退火溫度)的時候，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞，這就使PCR后期的過程成為可能。 　　
退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度： 　　
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T) 　　
復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃) 　　
在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合， 提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。